TOPO Cloning Protokolle

TOPO Klonen ist ein Prozess des Klonens , der nutzt in der Regel , 3 ' A-Reste , die thermodynamisch instabil sind und kombiniert sie mit einer Taq- DNA-Polymerase. Zusätzlich verwendet das Verfahren einen frischen PCR Produkt ( PCR) , die bei 4 Grad Celsius gelagert werden müssen . Diese Form der Klonierung optimiert die aktive Topoisomerase -I-Molekül an das Ende eines linearen Vektors hinzugefügt . Um TOPO Klonen durchzuführen, sollte ein bestimmtes Protokoll befolgt werden. Vorbereitung

Einige grundlegende Schritte unternommen werden können , um die Gesamt TOPO Klonen Prozess zu beschleunigen und dazu beitragen, den Erfolg werden. Erstens sollten Rohre von lebensfähigen Zellen auf Eis gegeben werden, um ihre Akzeptanz erhalten. Weiter sollte die Super optimalen Kultur (SOC) Medium Bakterienwachstum mit Nährstoffen angereichert ist, auf Raumtemperatur gebracht werden. Die selektiven Platten sollten dann auf 37 Grad Celsius vorgewärmt werden , so dass sie voll und ganz bereit, wenn es an der Zeit , sie zu nutzen kommt .
Kombination Zutaten

Um das Klonen beginnen Dabei sollte eine Kombination von 2 ul Polymerasekettenreaktion ( PCR) Produkt , 0,5 Mikroliter Salzlösung und 0,5 Mikroliter -Klonierungsvektor in einem 0,5 - ml- Zentrifugenröhrchen kombiniert werden. Sobald kombiniert , werden diese Zutaten müssen bei Raumtemperatur eingestellt und für fünf bis zehn Minuten inkubiert werden. Als nächstes werden die kombinierten Bestandteile auf " Top -10 chemisch kompetente Zellen " in einer 50 - Mikroliter- Röhrchen gegeben und auf Eis für weitere zehn Minuten angeordnet werden. Danach müssen die Zellen Hitze bei 42 Grad Celsius genau schockiert und auf Eis für eine weitere Minute platziert vor 180 Mikroliter der SOC-Medium hinzugefügt werden. Diese Mischung sollte dann in horizontaler Richtung bei 200 Umdrehungen pro Minute eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius geschüttelt werden.
Letzte Schritte

Eine Mischung von 50 Mikroliter und 100 Mikroliter jeder Reaktion sollte " auf LB + AMP + X -Gal -Platten und Inkubation ohne Schütteln über Nacht bei 37 C." plattiert werden Am nächsten Tag die drei weißen Kolonien von jeder Reaktion sollte aufgenommen und in 4 ml LB + Amp gegeben und über Nacht bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius inkubiert , während mit 200 UpM geschüttelt. Der letzte Schritt ist die Mini- Vorbereitung der Plasmide und warten , um zu sehen , ob der Prozess erfolgreich war.