Wie GSH Levels in Detecting ROS Verwenden

Glutathion oder GSH ist eine nicht-essentielle Tripeptid aus Cystein , Glutamat und Glycin gebildet . Es ist ein starkes Antioxidationsmittel , die die Zellen und Organe des Körpers vor den schädlichen Wirkungen von ROS oder reaktiven Sauerstoffspezies , die aus molekularem Sauerstoff als Ergebnis der verschiedenen Stoffwechselprozessen im Körper gebildet werden, schützt . Antioxidantien wie Glutathion, neutralisieren die ROS und Interaktion mit und eine Beschädigung der DNA-und Protein in den Zellen verhindern. Das Verhältnis der oxidierten und reduzierten Form von GSH in Ihrem Körper ist , das die ROS bedingten oxidativen Stress in Ihrem body.Things Sie
Spritze
Schmetterling Nadel
Centrifuge
Heparin -Natrium
Gefrierschrank
Sulfosalicylsäure
GSH Reaktionsmittel
Mikro
Lichtquelle
GSH -Standardlösung
Weitere Anweisungen anzeigen
1

zeichnen ca. 2 ml Blut durch Venenpunktion an den anticubetal Vene mit einer 23 -Gauge- Nadel Schmetterling auf eine 5 -ml-Spritze befestigt. In der Probe in Röhrchen mit Heparin-Natrium testen und sanft das Röhrchen zum Mischen .
2

Sammle die roten Blutkörperchen durch Zentrifugieren der Probe bei 2.500 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten. Einfrieren und Auftauen die Probe dreimal , um die Zellen zu brechen. Zentrifugieren Sie die Zell-Lysat -Lösung für 10 Minuten bei 12.000 rpm und 4 Grad , und sammeln den Überstand.
3

entfernen , die das Protein aus der Probe durch Zugabe von 5 Prozent Sulfosalicylsäure und Zentrifugieren der Probe bei 12.000 UpM für fünf Minuten bei 4 Grad . Bewahren Sie die deproteiniertes Stand bei -112 Grad.
4

Mix eine Thiol Nachweismittel , GSH -Reduktase , Nicotinamidadenindinucleotidphosphat und Assay-Puffer in Teilen von der Kit-Herstellers angezeigt, um die GSH Reaktionsmischung zu machen. Die Menge jeder Chemikalie hängt von der Anzahl der Tests, die Sie durchführen möchten . Verdünnen Sie die GSH Reaktionsgemisch in 5 Prozent Sulfosalicylsäure zu Konzentrationen von 16, 32 , 63 , 125, 250 und 500 Mikroliter zu erhalten.

5 : 1 bis 10 Mikroliter der deproteiniertes Blutprobe in die Vertiefungen einer Mikroplatte . In seriell verdünnt GSH -Standard -Lösung, die im Test-Kit ist , in jede Vertiefung , um das Gesamtvolumen von jeweils gut 10 Mikroliter zu bringen.
6

hinzufügen 90 Mikroliter der GSH Reaktionsmischung , die Sie gemacht in Schritt 4 in jede Vertiefung der Mikroplatte . Mischen Sie das Reagenz durch Schütteln der Platte für 30 Sekunden.
7

sofort die Extinktion , indem Sie die Platte unter Licht mit Wellenlängen von 405 und 415 Nanometern. Inkubiere die Platte für 30 Minuten. Nehmen Absorptionswerte nach alle fünf Minuten während der Inkubation .
8

verdünnen 6 Millimol der verarbeiteten Probe mit 5 Prozent Sulfosalicylsäure und trifluromethane Sulfonatlösung . Dadurch werden alle reduzierten GSH aus der Lösung zu entfernen. In 1 bis 10 micoliters dieser Lösung in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten und wiederholen Sie die Schritte 5, 6 und 7 auf. So helfen schätzen die Menge an oxidiertem GSH in der Probe.
9

Tragen Sie die Absorption und Proben Konzentration auf ein Diagramm , um die GSH -Kurve für beide reduzierten und oxidierten Glutathion erhalten. Berechnen des Verhältnisses zwischen den beiden Formen von GSH . Erhöhte Werte oxidativem GSH-Spiegel zeigen oxidativen Stress und ROS .