Wie Einrichten eines Freistehend -Patch -Clamp- Experiment zu Set

Die Patch-Clamp- Experiment wird zur einzigen lebenden Zellen zu messen . Er tut dies mit einer sehr feinen Pipette eng an die Membran in der einzigen Zelle (die äußere Schutzabdeckung ) gehalten . Die Eröffnung dieser Pipette ist nur etwa 1 Mikrometer (ein Tausendstel Millimeter ) und ist optisch mit einem Mikroskop kontrolliert. Die Zellen werden in einer Schale einheitliche Verwendung eines Zellablösewie Trypsin gehalten . Eine bestimmte Zelle ausgewählt wird und die Pipettenspitze an der Zellmembran angeordnet . Die Dichtheit wird mit Saug-und Teil der Membran gebildet wird, in die pipette.Things Sie brauchen
Zellplatte
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder PBS ( ohne Calcium und Magnesium)
Trypsin drawn Incubator
10 -Milliliter- Pipette
HEK (human epidermal keratinocyctes ) Medium
fetales Kälberserum (FCS )
Centrifuge
Externe Aufzeichnungslösung
Patch- Clamp -Chip
Twist Kappe
Elektroden
Weitere Anweisungen anzeigen
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einen Teller für Zellen zu erhalten. Zweimaliges Waschen der Platte mit 10 ml PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) ohne Calcium und Magnesium. In 2 Milliliter Detacher ( Trypsin) . Die Platte drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Beachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen abgelöst. Die Platte vorsichtig bewegen , um alle Zellen von der Unterseite der Platte zu lösen. 10 ml der HEK (human epidermal keratinocyctes ) und FCS ( fetales Rinderserum ) Medium. Verwenden Sie eine 10 -Milliliter- Pipette , um die Zellen auf und ab zu bewegen.
2

die Zellen unter dem Mikroskop beobachten , um sicherzustellen, dass sie einzelne Zellen sind . Pipette unter Verwendung des 10 - ml- Pipette , bis die Zellen einzeln, wenn nötig. Zentrifugieren der Zellen für zwei Minuten bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. Überstand verwerfen . Platzieren der Zellen in 10 ml fötales Kälberserum . Zentrifugieren der Zellen nochmals zwei Minuten bei 1.000 Umdrehungen pro Minute. Überstand verwerfen . Legen Sie die Zellen in 200 Mikroliter der externen Aufzeichnungslösung . Beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop einzelne Zellen mit einer glatten Membran.
3

Legen Sie die Kochsalzlösung in einem Patch-Clamp- Chip. Fügen Sie einen Tropfen von intrazellulären Elektrolytlösung , um den unteren Teil des Chips mit einer Pipette . Montieren Sie den Chip auf einen Drehverschluss . Die Drehkappe sollte die Referenzelektrode und Saugleitung enthalten . Fügen Sie einen Tropfen von extrazellulären Elektrolytlösung an der Oberseite des Chips mit einer Pipette . Die Elektrolytlösung kann für den Chip , um den Kontakt mit der Elektrode herzustellen . Mit 5 Mikroliter der Zellsuspension in Kochsalzlösung in den Chip. Positionieren Sie eine einzelne Zelle mit Saug- durch eine Pipette . Saug kann manuell durch durch die Pipette Ansaugen von Luft durchgeführt werden. Positionieren der Zellwiderstanderhöht , um eine Dichtung zu bilden. Die Dichtung kann zur Untersuchung der gesamten Zelle .