Wie Sanger Reagenzien verwenden

Sanger -Reagenz wird verwendet, um zu ermitteln, die Sequenz der Aminosäuren , aus denen ein Peptid . Oder Tag - - das Reagens auf das Latch- Aminosäure am Ende einer Peptidkette , die auch als N -Terminus bezeichnet. Das Peptid kann dann in Stücke gebrochen werden ( hydrolysiert ) und die einzelnen Aminosäuren unter Verwendung verschiedener Chromatographie- Methoden untersucht . Unabhängig davon, welche Aminosäure trägt das Etikett der einen am Ende . Sanger -Reagens auch als Dinitrofluorbenzol ( DNFB ) bekannt. Sobald es auf einer Aminosäure verriegelt hat , wird er als einer DNP - compound.Things bezeichnet wird Sie brauchen
Labormaßstab
Handschuhe
Sicherheitsbrille

Zentrifuge Zentrifugenröhrchen
Pasteurpipetten
Destilliertes Wasser
4,2% Lösung von Natriumbicarbonat
Sanger -Reagenz ( FDNB )
pH-Papier
Diethylether
6M Salzsäurelösung
Aceton
-Test Rohr
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1

abwiegen 3 Milligramm Peptid auf einer Skala . Legen Sie sie in ein Zentrifugenröhrchen . Mit ca. 0,3 ml Wasser, 0,3 ml der Sanger -Reagenz und 0,075 ml Natriumbicarbonat.
2

Den Zentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Während der Inkubation , schütteln Sie den Schlauch vorsichtig , um die Mischung aus der Trennung zu verhindern. Den pH-Wert der Lösung alle 15 Minuten mit pH-Papier . Der pH-Wert sollte über 9 gehalten werden. Wenn es fallen zu lassen , eine kleine Menge von Natriumbicarbonat ( etwa einen Tropfen mit der Pasteur-Pipette ) beginnt .
3

Nach der Inkubation , fügen Sie 1,5 ml Wasser und eine gleiche Menge Ether . Die Lösung wird in Schichten zu trennen. Sie haben , um die Mischung , um sie zu trennen Zentrifuge . Entfernen Sie die Ether-Schicht (die obere , gelbe Schicht ) mit einer Pipette und entsorgen.
4

den pH-Wert auf 1,0 durch langsame Zugabe von Salzsäure. Fügen Sie ein wenig von der Säure zu einer Zeit , vorsichtig umrühren , dann den pH-Wert mit pH- Papier. Insgesamt sollte sie etwa 0,15 ml Säure erforderlich. Wenn der pH-Wert unter 1,0 geht , eine kleine Menge (nicht mehr als ein Tropfen ) Natriumbicarbonat .
5

3 ml Äther. Um das Gemisch zu trennen. Nun ist die obere Schicht (die gelbe , Ether -Schicht) enthält Ihre DNP - Verbindung . Mit einer Pipette vorsichtig heraus diese Schicht und übertragen sie auf ein sauberes Reagenzglas. Das Reagenzglas beiseite und lassen die Flüssigkeit verdunsten, so dass hinter einem trockenen, gelben Feststoff.
6

Waschen Sie Ihre Feststoff mit Aceton . In 0,3 Milliliter Aceton, vorsichtig umrühren und extrahieren Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette . Hinzufügen 0,75 Milliliter Säure in das Reagenzglas . Ihre Peptid wird nun markiert und bereit, hydrolysiert und mit der Chromatographie -Methode Ihrer Wahl analysiert werden.