Trocknungsmethoden Protokoll für PVDF

Bei der Bindung von Nukleinsäuren oder Proteinen , bietet ein High- Material genannt PVDF ( Polyvinyldifluorid ) Membranträger für die Antikörper . Durch Western-Blotting werden die Membranen aufeinandergestapelt , um den Antikörper hergestellt und getrocknet. Protokoll zum Trocknen der Membran erfordert Wissen, wie Membranen arbeiten , Kathodenplatten , Anodenplatten und Anwendung von Methanol-Lösungen . Mit der richtigen Protokoll , die Membran sicher bindet mit dem spezifischen Antikörper und ist bereit für den sofortigen Einsatz oder Lagerung. Vorbereiten der Membran

Vorbereitung der PVDF-Membran reinigt und stabilisiert die Membran vor der Übertragung. Vor dem Trocknen wird die Membran " blockiert " Bindung von allem außer den spezifischen Nukleinsäuren , wie beispielsweise nichtspezifische Antikörper zu verhindern. Während dieser Prozedur , die Membran benetzen Sie durch Auflegen auf eine flache Oberfläche in Methanol bedeckt. Die Membran ändert sich die Farbe in diesem Satz, von opak bis semitransparent. Einmal mit der Methanol-Bad fertig ist, wird die Membran in entionisiertes Wasser gegeben , um für etwa zwei Minuten einweichen . Die Membran muss dann wieder genießen in einer Methanol-Lösung , die sehr sauer ist .
Versammlung der Membranen vor der Übertragung

Zwei der Membran Papiere werden in der ersten Methanollösung getränkt und einer Anodenplatte angeordnet . Während dieses Prozesses , müssen Sie sorgfältig prüfen eingeschlossene Luftblasen , die die Übertragung beeinträchtigen könnten . Ein weiteres Stück Filterpapier in der zweiten Methanollösung eingeweicht und oben auf dem Stapel abgelegt . Ein Gel geht dann oben auf der Membran , mit Sorgfalt keine Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran -Anwendung abzufangen. Drei neue Papierstücke werden dann in einer Kathodenpuffer eingeweicht und oben auf das Gel gelegt . Wenn eine Luftblasenbildungauftritt, wird ein Reagenzglas funktioniert zu glätten die Membranen .
Über

In diesem Teil des Prozesses , Hochspannungs verbinden Sie Kabel mit einer Stromversorgung und Anwendung eines konstanten Stroms zu dem Gel Bereich auf der Membran für 30 Minuten. Übertragungszeiten je nach Art des Antikörpers variieren. Nach 30 Minuten die Stromversorgung und Transfermembran , entfernen Sie . Die rechte untere Ecke der Membran wird dann geschnitten, um Orientierung zu überprüfen. Die ersten zwei Schichten des Filterpapiers , werden verworfen , wie das Gel. Die Bands für das Molekulargewicht sind mit einem Kugelschreiber markiert.
Trocknung

Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, wird die Membran in eine von zwei Arten trocknen Sie . Für eine schnellere Trocknung wird die Membran in 100 Prozent Methanol für 10 Sekunden, um jegliches Wasser zu entfernen getränkt. Die Membran liegt dann auf ein Stück Papiertuch für 15 Minuten. Für eine langsamere Trocknungsverfahren wird die Membran auf dem Papiertuch ohne Zugabe von Methanol gebracht . Einmal getrocknet , kann die Membran bei 4 Grad Celsius für den zukünftigen Gebrauch verwendet werden oder in einem trockenen Behälter gelagert werden .