Wie Gelfiltrationssäulen Kalibrieren

Gelfiltrationssäulen werden verwendet, um Proteine ​​aus komplexen Gemischen zu trennen. Da jedes Protein hat eine einzigartige Molekulargewicht , können sie dazu gebracht werden, in getrennte Schichten durch die Migration sie durch eine Filtersäule , die einen gleichmäßig verteilten Gelmatrix zu trennen. Um jedes Protein, das abgetrennt wird korrekt zu identifizieren , müssen Sie die Spalten, die Kalibrierung mit mehreren Proteinen bekannten Molekular weight.Things Sie brauchen
Carboanhydrase
Cytochrom C
Aprotinin
Basal Salz
Zentrifugenröhrchen
Ferritin
Centrifuge
Pipettieren pumpen
250 ml Messzylinder
Buffer Flüssigkeit
Scientific Reinigungstücher
Spritzenzylinder
Weitere Anweisungen 1

entfernen sie die Fläschchen der Carboanhydrase , Cytochrom C und Aprotinin aus dem Kühlschrank oder Gefrierschrank und lassen sie auf Raumtemperatur zu erreichen. Add 4 mg jedes Proteins in ein Zentrifugenröhrchen pro Milliliter Gel in der Filtrationssäule . In 961 mcl der basalen Salz pro Milligramm Protein zu jedem Zentrifugenröhrchen , um die Proteine ​​zu lösen. In 39,2 mcl von Ferritin pro Milliliter Gel zu jedem Rohr und dann in einer Zentrifuge zu mischen.
2

Schalten Sie die FilterpumpeSpalte und schließen Sie den Wasserhahn an der Säule Eingang. Abschrauben , aber nicht entfernen , das obere Ende der Filtration Spalte. Die Pumpe auf die maximale Durchflussrate für die Spalte und die Pumpe starten , bis das Puffermaterial abgezogen wurde . Stoppen Sie die Pumpe .
3

1 ml jedes Proteins auf die Filtrationssäule unter Verwendung eines Pipettenpumpe . Tropft die Proteine ​​an der Innenseite der Säule aus einer Höhe von 1 cm bis 2 cm, die rund um die Innenkante der Spalte. Lassen Sie das Proteingemisch , um oben auf der Gel-Matrix zu begleichen.
4

Setzen Sie den Ablaufschlauch der Pumpe in einem sauberen, trockenen 250-ml- Messzylinder. Starten Sie die Pumpe mit einer Rate von 0,30 ml pro Minute und führen die Proteine ​​in das Gel -Matrix. Während die Pumpe läuft, spülen Sie die Seiten der Röhre mit der Pipettenpumpe und eine kleine Menge an Pufferflüssigkeit . Sobald die Proteine ​​vollständig die Gel-Matrix eingegeben , reduzieren Sie die Pumpendrehzahl bis 0,02 ml pro Minute und Pumpe in einem 5 cm bis 7 cm dicken Schicht Pufferflüssigkeit auf der Matrix.
5

Trennen Sie die Spalte Kappe vom Hahn . Reinigen Sie die Spalte Kappe und das Innere der Säule mit wissenschaftlichen Reinigungstücher . Installieren Sie die Spalte Kappe . Füllen Sie den Pufferspeicher mit Pufferflüssigkeit . Bringen Sie einen Spritzenzylinder , um den Hahn und öffnen. Verwenden der Spritze , um eine kleine Menge an Puffer durch den Schlauch und in die Spritze zu ziehen. Schließen Sie den Wasserhahn und bringen Sie ihn in die Spalte oben . Öffnen Sie den Wasserhahn und Dichtheit prüfen.

6 Führen Sie die Säule mit 0,02 ml pro Minute für mehrere Tage, bis der Ferritin- Band nähert sich dem Ende der Spalte. Sammeln Sie alle Filtration Gel, das in den Messzylinder gepumpt wird.