GSH -Assay -Protokolle

Glutathion oder GSH ist ein Protein in Pflanzen und Tieren gefunden. Es funktioniert, um Enzymreaktionen bei der Entgiftung von Umweltschadstoffen zu helfen. Außerdem Aminosäure-Transport erleichtert es innerhalb von Zellen und hilft Sulfhydryl Reduktionsreaktionen Protein zu erhalten. GSH -Assay -Protokolle verwenden GSH Puffer, Standards , Substrat, Enzyme und Reagenzien. Nach der speziellen Verfahren ist relevant für das Ergebnis des Tests . Die enzymatische Methode Recycling

Die enzymatische Recyclingverfahren , für GSH , verwendet Glutathion-Reduktase zu GSH zu quantifizieren. Dieses Protokoll ist speziell für Plasma , Gewebe-oder Zellproben kultiviert . Fügen Sie das Reagenz DTNB (5 -5'- Dithio- bis-2- Nitrobenzoesäure ) an GSH . Die Sulfhydrylgruppen in GSH reagiert mit dem Reagenz und erzeugt eine gelbe Säure namens 5 -Thio- 2 -Nitrobenzoesäure ( TNB ) . In Glutathion-Reduktase auf die Säure und GSH Mischung GSH recyceln und produzieren mehr Säure . In diesem Verfahren ist die Geschwindigkeit der Säureproduktion proportional zum Recycling Reaktion GSH ; Deshalb messen die Absorption der TNB Säure mit einem Spektralphotometer . Die Absorption liefert eine Schätzung der tatsächlichen Menge an GSH in der Probe.
Leberzell Glutathion Assay

Dieses Protokoll analysiert die Menge an GSH in menschlichen Leberzellkarzinom ( Leberkrebs Zellen) . Um dieses Verfahren durchführen , verwenden Sie die farbmetrische Methode zur Bestimmung GSH zu reduzieren und oxidieren GSH . Reduzieren Sie mit GSH 5 -5'- Dithiobis (2- Nitrobenzoesäure oder DTNB ), um die

farbigen Produkt 2- Nitro-5- Thiobenzoesäure und oxidiertem Glutathion (GSSG ) zu bilden. Verwenden Glutathion-Reduktase zu GSH GSSG zu reduzieren, um wieder zu bilden. Um die Menge der GSH in den Leberzellen zu messen , lesen Sie die Probe bei 415 Absorption kinetisch auf einem Mikroplatten-Reader .
Zell-Apoptose

diese Protokoll GSH wird zur Apoptose (Tod ) durch die Messung der Abnahme des reduzierten GSH erfassen. Eine Abnahme in der Konzentration des zellulären GSH ist ein Indikator des Zelltods . Färben die Probe Zellen mit nicht-fluoreszierenden thiolite grün. Die thiolite grünen sammelt sich im Cytosol (Zellplasma ) und Mitochondrien ( Kraftwerk ) der Zelle . Verwenden Sie ein Durchflusszytometer bei 490/520 Nanometer , die Menge der GSH in den Zellen sichtbar zu machen.
Gesamtkonzentration von GSH in Tier-und Pflanzenproben

messen die Konzentration von Gesamt GSH sowohl in der reduzierten und oxidierten Form in verschiedenen Tier-und Pflanzenproben . In der allgemeinen Thiolreagens , 5 -5'- Dithiobis [2- Nitrobenzoesäure ] . Das Thiol -Reagenz reagiert mit GSH bis 412 nm Chromophor , 5 - Thionitrobenzoesäure ( TNB ) und GS- TNB bilden. Hinzufügen Glutathionreduktase und Beta - Nikotinamid-Adenin- Dinukleotid-Phosphat ( NADPH) zu GS- TNB reduzieren. Die Glutathion führt auch zur Freigabe eines zweiten TMB -Molekül und Recycling der GSH . Zusätzlich ist jede oxidierte GSH (GSSG ) in der Mischung aus der Reaktions Disulfid fromed vorliegende auch GSH verringert. Verwenden Sie eine Mikroplatten-Reader bei 405 Nanometern , um die Absorption Niveau lesen und zeigen die Gesamtkonzentration der GSH .